從HTLV-1感染到ATL的發(fā)展，細(xì)胞是如何分階段變化的?

國(guó)家癌癥中心研究所9月6日宣布，該所利用最新技術(shù)--單細(xì)胞多組學(xué)分析，闡明了人類(lèi)T細(xì)胞白血病病毒1型(HTLV-1)感染引起的成人T細(xì)胞白血病/淋巴瘤(ATL)的多步驟致癌的分子機(jī)制。 這項(xiàng)研究是由該研究所分子腫瘤學(xué)系的高級(jí)研究員古谷淳史、志愿實(shí)習(xí)生齋藤由紀(jì)、慶應(yīng)義塾大學(xué)醫(yī)學(xué)院內(nèi)科(血液學(xué))系的教授片岡圭介(他還擔(dān)任國(guó)家癌癥中心分子腫瘤學(xué)部主任)和宮崎大學(xué)醫(yī)學(xué)院血液學(xué)、糖尿病和內(nèi)分泌學(xué)系的教授下田和也領(lǐng)導(dǎo)的研究小組進(jìn)行的。 和京都大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究生院腫瘤生物學(xué)系的小川誠(chéng)司教授。 該研究的結(jié)果已發(fā)表在《血癌發(fā)現(xiàn)》上。

成人T細(xì)胞白血病/淋巴瘤(ATL)是一種造血腫瘤(血癌)，是由HTLV-1感染引起的CD4陽(yáng)性T細(xì)胞腫瘤，在日本發(fā)病率很高。 主要的感染途徑是在嬰兒期通過(guò)母乳進(jìn)行母嬰傳播。 近年來(lái)，由于徹底的健康指導(dǎo)，無(wú)癥狀攜帶者和ATL新病例的數(shù)量一直在減少。 近年來(lái)，由于健康指導(dǎo)和其他措施，無(wú)癥狀攜帶者的數(shù)量和ATL的新病例一直在減少。 然而，ATL仍然每年影響約700人，而且預(yù)后很差，除了造血干細(xì)胞移植外沒(méi)有治愈性治療。

HTLV-1感染后，病毒衍生的蛋白Tax會(huì)引起CD4陽(yáng)性T細(xì)胞的永生化，但只有不到5%的HTLV-1攜帶者最終會(huì)發(fā)展為ATL，主要是通過(guò)免疫反應(yīng)。 發(fā)展ATL需要很長(zhǎng)的時(shí)間。 據(jù)推測(cè)，在這段漫長(zhǎng)的時(shí)間里，不僅是HTLV-1感染的細(xì)胞，而且還有免疫細(xì)胞，主要是淋巴細(xì)胞，它們之前一直在監(jiān)測(cè)和抑制HTLV-1感染細(xì)胞的增殖，發(fā)生了變化，導(dǎo)致存在異質(zhì)性的細(xì)胞特征。

然而，迄今為止的研究技術(shù)只允許在不同類(lèi)型的細(xì)胞混合物上進(jìn)行全面的基因表達(dá)分析，并且只能確定數(shù)百至數(shù)萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的異質(zhì)群體的平均狀態(tài)。 然而，最近的技術(shù)創(chuàng)新使得在單細(xì)胞水平上進(jìn)行全面的基因表達(dá)分析成為可能，通過(guò)從含有多種細(xì)胞類(lèi)型的臨床樣本中分離出單個(gè)細(xì)胞，從而評(píng)估細(xì)胞群的異質(zhì)性和多樣性。 研究小組利用單細(xì)胞多組學(xué)分析，即這種單細(xì)胞基因表達(dá)分析技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，來(lái)研究HTLV-1和ATL中感染細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞的異質(zhì)性和多樣性。

作為一種研究方法的 "單細(xì)胞多分子分析

單細(xì)胞多組學(xué)分析是一種最先進(jìn)的研究方法，不僅能提供單個(gè)細(xì)胞的綜合基因表達(dá)數(shù)據(jù)，還能提供100多個(gè)細(xì)胞表面標(biāo)志物和T細(xì)胞/B細(xì)胞受體復(fù)合物的信息。

在常規(guī)的臨床實(shí)踐中，使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面標(biāo)志物，是對(duì)細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行分類(lèi)的一個(gè)非常有用的工具，但直到現(xiàn)在，由于技術(shù)問(wèn)題，每次只能對(duì)單個(gè)細(xì)胞的幾個(gè)到20個(gè)細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行檢查。 在這項(xiàng)研究中，我們使用了針對(duì)每種標(biāo)記物的抗體的寡核苷酸條碼，然后可以在下一代測(cè)序儀上進(jìn)行分析，這使得原則上可以同時(shí)測(cè)量超過(guò)幾千個(gè)細(xì)胞表面標(biāo)記物。 在血液學(xué)和免疫學(xué)中，細(xì)胞表面標(biāo)志物已被用來(lái)對(duì)細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行分類(lèi)以進(jìn)行功能分析。 新方法是一個(gè)創(chuàng)新的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，將積累的表面標(biāo)志物信息與全面的單細(xì)胞基因表達(dá)分析結(jié)果直接聯(lián)系起來(lái)。

它也非常有用，因?yàn)樗试S我們結(jié)合T細(xì)胞和B細(xì)胞受體的重復(fù)。 要區(qū)分正常淋巴細(xì)胞、非腫瘤感染的淋巴細(xì)胞和腫瘤性ATL細(xì)胞是非常困難的，這一直是研究ATL發(fā)病機(jī)制的一個(gè)障礙。 現(xiàn)在，通過(guò)同時(shí)獲得T細(xì)胞受體-肝臟信息，可以明確區(qū)分單克隆增殖的腫瘤細(xì)胞。

通過(guò)將這種單細(xì)胞分析與個(gè)別臨床標(biāo)本的基因畸變、患者的臨床數(shù)據(jù)以及一系列功能實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，研究人員能夠提供HTLV-1感染和ATL發(fā)病機(jī)制的全面情況，提高對(duì)發(fā)病機(jī)制的理解，并確定新的治療目標(biāo)。

在單細(xì)胞水平上準(zhǔn)確識(shí)別HTLV-1感染的細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞群的表達(dá)分析

首先，用4個(gè)健康捐贈(zèng)者樣本、11個(gè)無(wú)癥狀的HTLV-1感染攜帶者和34個(gè)ATL外周血單核細(xì)胞來(lái)分選有活力的細(xì)胞，然后用寡核苷酸標(biāo)記102抗體，制備RNA樣本進(jìn)行單細(xì)胞分析，并使用新一代的 測(cè)序。 我們從總共49個(gè)樣本中獲得了233,093個(gè)細(xì)胞的綜合基因表達(dá)、細(xì)胞表面標(biāo)志物和T細(xì)胞/B細(xì)胞受體復(fù)合物的信息。

在綜合基因表達(dá)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，用統(tǒng)一的矩陣逼近和投影(UMAP)方法將聚類(lèi)的結(jié)果繪制成二維圖。 此外，有代表性的細(xì)胞表面標(biāo)志物被用來(lái)劃分每個(gè)細(xì)胞群屬于哪種細(xì)胞類(lèi)型，根據(jù)上述T細(xì)胞受體重復(fù)分析的結(jié)果，CD4陽(yáng)性T細(xì)胞被分為腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞。

然后提取非腫瘤CD4陽(yáng)性T細(xì)胞，重新聚類(lèi)并重新繪制在二維表面上，并與HTLV-1衍生的mRNA--HBZ的表達(dá)水平相疊加。 我們能夠清楚地區(qū)分非感染性的幼稚和效應(yīng)記憶CD4陽(yáng)性T細(xì)胞和非腫瘤性的HTLV-1感染的CD4陽(yáng)性細(xì)胞。 這項(xiàng)工作可以對(duì)非感染的正常CD4陽(yáng)性T細(xì)胞、非腫瘤HTLV-1感染的CD4陽(yáng)性細(xì)胞和腫瘤ATL細(xì)胞之間的基因表達(dá)進(jìn)行比較分析。

分析顯示，與未感染的幼稚和效應(yīng)記憶CD4陽(yáng)性T細(xì)胞相比，在非腫瘤HTLV-1感染的細(xì)胞中，一組對(duì)抗原呈現(xiàn)很重要的分子的表達(dá)明顯上調(diào)。 對(duì)上調(diào)最多的mRNA分子LGALS1的功能分析顯示，LGALS1的高表達(dá)使感染的細(xì)胞能夠避免細(xì)胞毒性T細(xì)胞攻擊誘發(fā)的凋亡。

細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)分析確定CD99是一種分子，其表達(dá)隨著從非HTLV-1感染的CD4陽(yáng)性T細(xì)胞發(fā)展到HTLV-1感染的CD4陽(yáng)性T細(xì)胞，然后發(fā)展到ATL而增加。 這可能是一個(gè)新的治療目標(biāo)。

HTLV-1感染細(xì)胞的克隆擴(kuò)展程度可能是ATL進(jìn)展的一個(gè)生物標(biāo)志物

研究人員還關(guān)注了非腫瘤性HTLV-1感染的CD4陽(yáng)性T細(xì)胞，并疊加了T細(xì)胞受體曲目。 他們發(fā)現(xiàn)，一些非腫瘤性HTLV-1感染的CD4陽(yáng)性T細(xì)胞已經(jīng)在克隆生長(zhǎng)。 重要的是，在無(wú)癥狀攜帶者樣本中，克隆增殖的程度與外周血單核細(xì)胞中HTLV-1感染的CD4陽(yáng)性T細(xì)胞的比例成正比，表明這是一個(gè)潛在的ATL進(jìn)展的生物標(biāo)志物。

對(duì)非腫瘤性HTLV-1感染的CD4陽(yáng)性細(xì)胞的基因表達(dá)分析，分為非克隆性感染細(xì)胞和克隆性增殖細(xì)胞，顯示在感染期間上調(diào)的MHC II類(lèi)分子在克隆性增殖感染的CD4陽(yáng)性T細(xì)胞中下調(diào)，這表明逃避免疫系統(tǒng)有助于克隆性增殖。

HTLV-1感染和ATL進(jìn)展過(guò)程中免疫微環(huán)境的變化

為了評(píng)估HTLV-1感染和ATL發(fā)展過(guò)程中的免疫微環(huán)境，我們比較了非腫瘤細(xì)胞中各血細(xì)胞部分的比例。 我們發(fā)現(xiàn)在HTLV-1和ATL中都觀察到CD8陽(yáng)性T細(xì)胞的減少，而B(niǎo)細(xì)胞的減少和骨髓細(xì)胞的增加則是ATL狀態(tài)的特有現(xiàn)象。

還分析了腫瘤細(xì)胞的基因異常對(duì)免疫微環(huán)境的影響：20-30%的ATL病例有CD274的mRNA結(jié)構(gòu)異常，CD274編碼免疫檢查點(diǎn)分子PD-L1，這些異常增加了ATL細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)，有助于逃避免疫機(jī)制的影響。 這種基因異常已被證明可上調(diào)ATL細(xì)胞的PD-L1表達(dá)，有助于它們逃避免疫系統(tǒng)。 分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞的這種基因異常也會(huì)導(dǎo)致PD-L1在非腫瘤細(xì)胞如B細(xì)胞和骨髓細(xì)胞中的表達(dá)增加。

研究人員分析了Pd-l1在基因工程小鼠中的表達(dá)，這些小鼠專(zhuān)門(mén)模仿了CD4陽(yáng)性T細(xì)胞中的Pd-l1 mRNA結(jié)構(gòu)異常。 我們發(fā)現(xiàn)Pd-l1的表達(dá)不僅在CD4陽(yáng)性T細(xì)胞中上調(diào)，而且在骨髓細(xì)胞中也上調(diào)，表明Pd-l1蛋白確實(shí)在體內(nèi)轉(zhuǎn)移到其他細(xì)胞。

轉(zhuǎn)移到非腫瘤細(xì)胞的PD-L1也可能影響免疫微環(huán)境的變化

為了了解轉(zhuǎn)移到非腫瘤細(xì)胞的PD-L1是否參與了ATL的發(fā)病機(jī)制，該研究小組進(jìn)行了共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。 首先，他們將永生化的HEK293T細(xì)胞與正常外周血單核細(xì)胞共同培養(yǎng)，并發(fā)現(xiàn)PD-L1確實(shí)被轉(zhuǎn)移到了細(xì)胞中。 此外，當(dāng)PD-L1轉(zhuǎn)染的正常外周血單核細(xì)胞與活化的CD8陽(yáng)性T細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)它們能抑制CD8陽(yáng)性T細(xì)胞的增殖。

這項(xiàng)單細(xì)胞多組學(xué)分析還顯示，在PD-L1失調(diào)的患者中，CD8陽(yáng)性T細(xì)胞的比例減少，這表明不僅腫瘤細(xì)胞上PD-L1的高表達(dá)，而且轉(zhuǎn)移到非腫瘤細(xì)胞上的PD-L1也可能影響免疫微環(huán)境的變化。

單細(xì)胞多組學(xué)分析有助于闡明以前在技術(shù)上不可能實(shí)現(xiàn)的致癌機(jī)制

這項(xiàng)研究是迄今為止對(duì)單一疾病進(jìn)行的最大規(guī)模的單細(xì)胞多組學(xué)分析，全面展示了由HTLV-1感染引起的ATL的致癌分子機(jī)制，包括受感染的細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和免疫微環(huán)境。

正如這項(xiàng)研究所顯示的，單細(xì)胞多組學(xué)分析在揭示致癌機(jī)制方面極為有用，而這些機(jī)制在技術(shù)上是不可能用常規(guī)分析方法找到的。 該研究小組說(shuō)："我們將繼續(xù)在單細(xì)胞多組學(xué)分析方面進(jìn)行創(chuàng)新，并將該技術(shù)應(yīng)用于臨床實(shí)踐，目的是進(jìn)一步闡明全部致癌機(jī)制，并確定可能對(duì)疾病更有針對(duì)性、副作用更小的治療目標(biāo)。